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蛋白質含量的測定

放大字體  縮小字體 發布日期:2005-10-08  瀏覽次數:33716

衡量食品的營養成分時,要測定蛋白質含量,但由于蛋白質組成及其性質的復雜性,在食品分析中,通常用食品的總氮量表示,蛋白質是食品含氮物質的主要形式,每一蛋白質都有其恒定的含氮量,用實驗方法求得某樣品中的含氮量后,通過一定的換算系數。即可計算該樣品的蛋白質含量。

    一般食品蛋白質含氮量為l0%如肉、蛋、豌豆、玉米等,其換算系數為6.25,小麥取5.70,大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17,動物膠5.55。

    一、目的與要求:

    掌握微量凱氏法測定蛋白質總氮量的原理及操作技術。包括樣品的消

化,蒸餾吸收及滴定與含氮量的計算。

    二、原理:

    凱氏定氮法:食品經加硫酸消化使蛋白質分解,其中氮素與硫酸化合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離,用硼酸液吸收后,再用鹽酸或硫酸滴定根據鹽酸消耗量,再乘以一定的數值即為蛋白含量,其化學反應式如下。

    (1)  2NH2(CH2)2COOH+13H2S04    (NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2

    (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4

    (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O

(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2

三、試劑與儀器:

1、硫酸鉀

2、硫酸銅   

3、硫酸

4、2%硼酸溶液

5、40%氫氧化鈉溶液

6、混合指示劑:把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚綠溶液10毫升和溶于95%乙醇的0.l%甲基紅溶液2毫升混合而成.

    7、0.OINHCL標準溶液或0.01N硫酸標準溶液.

8、凱氏微量定氮儀一套。

9、定氮瓶100m1或50ml一只。

10、三角瓶150ml 3只。

11、量筒50ml、lOml、lOOml。

12、吸量管10ml只。

13、酸式滴定管1支。

14、容量瓶100毫升1只。

15、小漏斗1只。

四、操作方法:

1、  樣品處理:精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品(約相當氮30-40mg),移入干燥的100ml500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸銅,3g硫酸鉀及20毫升硫酸,稍搖勻后于瓶口放一小漏斗,將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網上,小火加熱,待內容物全部炭化,泡沫完全停止后,加強火力,并保持瓶內液體微沸,至液體呈藍綠色澄清透明后,再繼續加熱0.5小時。取下放冷,小心加20ml水,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸銨同一方法做試劑空白試驗。

2、  按圖裝好定氮裝置,于水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入數粒玻璃珠以防暴沸,用調壓器控制,加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。

3、  想接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室,并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內,塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其緩慢流入反應室,立即將玻璃蓋塞緊,并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾,開始蒸餾,蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內,蒸餾5min。移動接收瓶,使冷凝管下端離開液皿,再蒸餾1min,然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶,以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。

同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

計算:

X =(V1-V2*N*0.014)/( m*10/100) +F*100 

X:樣品中蛋白質的含量,g;

V1:樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積,ml;

V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積,ml;

N:硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度;

0.0141N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數;

m:樣品的質量(體積),gml);

F:氮換算為蛋白質的系數。

   注:

1       樣品應是均勻的,固體樣品應預先研細混勻,液體樣品應振搖或攪拌均勻。

2       樣品放入定氮瓶內時,不要沾附頸上,萬一沾附可用少量水沖下,以免被檢樣消化不完全,結果偏低。

3       消化時如不容易呈透明溶液,可將定氮瓶放冷后,慢慢加入30%過氧化氫2-3ml,促使氧化。

4       在整個消化過程中,不要用強火,保持和緩的沸騰,使火力集中在凱氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下。使氮有損失。

5       如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會引起氨的損失,這樣會形成硫酸氫鉀,而不與氨作用,因此當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時,要增加硫酸的量。

6       加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點,硫酸銅為催化劑,硫酸銅在蒸餾時作堿性反應的指示劑。

7       混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠,可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

8       氨是否完全蒸餾出來,可用PH試紙試餾出液是否為堿性。

9       吸收葉也可以用0.01當量的酸代表硼酸,過剩的酸液用0.01N堿液滴定,計算時,A為試劑空白消耗堿液數,B為樣品消耗堿液數,N為堿液濃度,其余均相同。

10   以硼酸為氨的吸收液,可省去標定堿液的操作,且硼酸的體積要求并不嚴格,亦可免去用移液管,操作比較簡便。

11   向蒸餾瓶中加入濃堿時,往往出現褐色沉淀物,這是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應,生成氫氧化銅,經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用,生成深蘭色的結合物[Cu(NH3)4]++

 
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