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『深度剖析』新冠病毒各種檢測方法優缺點對比

放大字體  縮小字體 發布日期:2021-02-04  瀏覽次數:86
核心提示:新型冠狀病毒的檢測方法主要包含核酸檢測、抗體檢測、抗原檢測幾種方法。由于抗原檢測檢出率較低,目前新冠檢測主要集中在抗體和核酸檢測。核酸檢測目前是新型冠狀病毒檢測的“金標準”,具有早期診斷、靈敏度和特異性高等特點;但抗體檢測操作便捷、檢測迅速,可作為核酸診斷的補充手段,但由于抗體檢測“假陽性”和“假陰性”的局限性,不適合用于復工復產復學等普通人群篩查,也不適用于在低流行地區的流行病學調查。
 

核酸檢測

 

  • 檢測原理:


所有生物除朊病毒外都含有核酸,核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于Beta冠狀病毒屬(Betacoronavirus),該病毒是蛋白包裹的單鏈正鏈RNA病毒,寄生和感染高等動物(包括人)。病毒中特異性RNA序列是區分該病毒與其它病原體的標志物,新型冠狀病毒出現后,我國科學家已經成功發現了新型冠狀病毒中的特異性核酸序列。如疑似患者樣本中能檢測到新型冠狀病毒的特異性核酸序列,則認為該患者可能被新型冠狀病毒感染。
 
新型冠狀病毒常用的核酸診斷方法有兩種:病毒核酸特異基因檢測和病毒基因組測序。最常見的檢測新型冠狀病毒特異性核酸序列的方法是熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應)。由于新型冠狀病毒是RNA病毒,試劑盒檢測基本都采用反轉錄加實時聚合酶鏈式反應法(RT-PCR),擴增病原體的核酸 (RNA) ,同時通過熒光探針實時檢測擴增產物。在PCR反應體系中,包含一對特異性引物以及一個Taqman探針,該探針為一段特異性寡核苷酸序列,兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;如反應體系存在靶序列,PCR反應時探針與模板結合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解,報告基團與淬滅基團分離,發出熒光。每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數(Ct值)與病毒核酸濃度有關,病毒核酸濃度越高,Ct值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的陽性判斷值。

 

由于每個RT-PCR反應需要2個小時左右才出結果,因此,試劑盒在開發時一般都針對病毒序列中高度保守的2-3個序列比如編碼replicase(復制酶)或者necleocapsid(核蛋白衣,核鞘)的核酸序列設計引物,但是各個方法用的序列都不完全相同。一些方法使用multiplex,也就是把多個目標序列在同一反應管中擴增;另一些采用分步,先用一個目標序列篩查,陽性后再用另一個序列確認,這樣可以有效縮短整個流程時間,加快檢測速度。另外RNA病毒變異很快,用多個保守目標序列可以防止病毒變異造成的假陰性。

目前批準產品均基于新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b(open reading frame 1ab,ORF1ab)、包膜蛋白(Envelope protein,E)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N)進行選擇。不同產品的檢測原理基本一致,但是其引物、探針設計存在不同,有單靶區段(ORF1ab)、雙靶區段(ORF1ab、N蛋白)、三靶區段(ORF1ab、N蛋白和E蛋白)的檢測和判讀差別。一般檢測位于病毒ORF1ab和N基因上的兩個靶標,同一份標本需滿足雙靶標陽性或重復檢測為單靶標陽性或兩種標本同時滿足單靶標才能確認SARS-CoV-2病毒核酸陽性。

 

  • 檢測流程:

檢測程序需要經過五個步驟,取樣、留樣、保存、核酸提取、上機檢測。首先根據試劑盒說明書進行樣本采集,樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于RNA易降解,因此,采集樣本時使用無RNA酶的拭子和無RNA酶的儲存管。獲得患者樣本后,需盡快進行檢測,如無法立即檢測需要進行低溫封裝,并送到專門的檢測機構進行檢測。檢測機構收到樣本后,對樣本進行核酸提取,核酸提取試劑應使用批準產品說明書中指定的核酸提取試劑盒。最后是熒光PCR核酸檢測,也就是上機器檢測,將提取物進行熒光PCR擴增反應,需要70—80分鐘。

 

抗體檢測

 

病毒侵入人體后,人體會產生相應的特異性抗體進行防御。免疫球蛋白是機體在抗原物質刺激下由漿細胞產生的一類能與抗原特異性結合的血清活性成分,根據分子結構和抗原特異性的不同,將免疫球蛋白分為五類:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。

 

抗原初次進入機體后,經過一定的潛伏期產生漿細胞并合成分泌抗體。最早出現的是IgM,但該抗體維持時間短、濃度低、親和力較低,在血中持續數日至數周,是急性期感染的診斷指標;在IgM接近消失時,IgG的含量達到高峰,IgG產生晚,但濃度高、維持時間長、親和力高,血清IgG陽性提示感染中后期或既往感染,當數月乃至數年再次接觸相同抗原時,最初原抗體量稍有下降,可能是由于一部分原有抗體被再次進入的抗原所結合,從而暫時降低了抗體含量,但短期內抗體含量迅速增加,可能比原來抗體含量高數倍至數十倍,以IgG為主,在體內持續時間也長,IgM很少增加。

本次疫情中,通過研究者對COVID-19患者進行研究發現,病毒侵入人體后,IgM抗體大約需要5-7天產生,IgG抗體在10-15天時產生。2020年3月4日,國家衛生健康委員會發布了最新版本的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》在原有診療方案的基礎上增加了血清學檢測,作為確診病例和疑似病例的診斷依據之一。血清學檢測便是通過檢測血液樣本中的特異性抗體IgM和IgG的存在及含量,來間接判斷體內有無病毒及病毒感染情況。目前臨床中常用的抗體血清學檢測方法有3種:酶聯免疫吸附試驗法、化學發光免疫分析法、膠體金免疫層析法。

 

  • 酶聯免疫吸附法(ELISA)

ELISA是一種結合抗原、抗體特異性反應和酶對底物高效催化作用的高敏感性免疫學實驗技術。測定時,受檢的標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應結合在固相載體上。固相上的酶量與標本中的受檢物質的量成比例。加入酶反應底物后,底物被催化成有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關。所以,可根據呈色的深淺進行半定量或定性分析。該檢測方法靈敏度較高,載體標準化難度較低,但檢測速度慢、易污染、步驟較為繁瑣。在實際應用中,需要根據抗原抗體的特性設計不同的檢測法,目前有雙抗體夾心法、免疫抑制法、競爭法、直接法&間接法等類型。

 

  • 膠體金免疫層析法

是以膠體金為示蹤標志物,應用于抗原抗體檢測的一種新型免疫標記技術,氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下,可聚合成一定大小的金顆粒,形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態,故稱膠體金。膠體金試紙,是將膠體金標記的生物大分子在PVC材質的試紙固定,留加樣孔,并設檢測線和質量控制線。在加樣孔上加入樣品后,再滴加液體介質,試紙上進行層析。根據試紙上的免疫反應發生結果,即膠體金位置是否有紅色條帶出現判斷檢測結果。


該方法無需特殊處理標本,僅需一滴血即可在15 min內通過肉眼觀察獲取檢測結果,突破了現有檢測技術對人員、場所的限制,縮短檢測時間,操作方便快速,在基層醫療單位及現場檢測中廣泛使用。目前針對新型冠狀病毒,已經報道的有兩種膠體金試紙,一種是檢測新型冠狀病毒的抗原-雙抗體夾心法,另一種是檢測患者血液里特異性針對新型冠狀病毒的IgM抗體-IgM捕捉法。在疫情爆發期,需要大規模做陽性檢測時,適合使用總抗檢測,同時聯卡操作也比較簡單,只需要操作一次,而分開檢測需要滴加兩次樣,用兩次卡。

  • 化學發光免疫分析法

化學發光免疫分析法是將高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合,用于各種抗原、抗體、激素等檢測。該法靈敏度高于 ELISA,具有特異性強、線性范圍寬、結果穩定、操作簡化等特點,廣泛應用于臨床標本的檢測。但是該方法對設備、操作、使用環境的要求比較高,使用時需要配套的化學發光儀器。

 

抗體檢測的靈敏度和特異度:靈敏度反映診斷試驗檢出感染者的能力,若過低,會出現較多假陰性結果,影響疾病的診斷、干預和預后,嚴重可導致患者過早死亡;特異度衡量診斷試驗正確判斷非感染者的能力,若過低,則會出現較多假陽性結果,導致醫療資源的浪費,并造成患者及群眾的焦慮和恐慌。因此,具有較高靈敏度和特異度是抗體檢測技術的應用基礎。

 

不同檢測方法優缺點對比

 

與抗體血清學檢測相比,核酸檢測能夠檢測到處于窗口期的患者,及早發現感染者,是新型冠狀病毒檢測的“金標準”,但是對檢測設備或平臺要求較高,高靈敏度的RT-PCR儀價格昂貴,對實驗室的潔凈度和操作人員要求也較高。此外,核酸檢測耗時較長,考慮到樣本運輸、樣本積壓的情況,通常最快24小時才可以報告結果。


與核酸檢測相比,抗體血清學檢測的血液標本更易獲取且標本質量有保證、操作簡單快捷、很大程度上降低了醫護人員在標本采集和檢測過程中被感染的風險、更易于基層實驗室展開篩查工作等。如果說核酸檢測病毒的核糖核酸(RNA),是病毒存在的直接證據,那么抗體檢測的就是患者血液中被刺激產生的抗體,是間接證據,對臨床有提示作用。當核酸檢測陰性時,將IgM和IgG抗體檢測增加進去,可以彌補核酸檢測容易造成漏診的缺點。

目前市場上主流的抗體檢測方法學是化學發光,但化學發光平臺對設備、操作、使用環境的要求比較高。對比核酸檢測,化學發光的核心優勢就是取樣及操作簡易,但沒有快速檢測的優勢。針對于普通篩查或者說針對于非發達國家,膠體金檢測方法對人員、場地、設備要求都非常低,適用于大規模的快速檢測。國際企業如羅氏、雅培等在膠體金方面是沒有技術儲備的,實際上全球的膠體金檢測(包括新冠肺炎、傳染病、流感、瘧疾、性病等)大部分的供應量還是在中國。

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編輯:songjiajie2010

 
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