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標準菌驗收、制備、保藏、 傳代、使用、銷毀的管理

放大字體  縮小字體 發布日期:2010-12-31  瀏覽次數:12303
核心提示:介紹了微生物實驗中使用的標準菌的驗收、制備、保藏、 傳代、使用、銷毀的管理規程 規定了質量管理部門實驗用標準菌種的驗收、制備、儲管、使用、以及銷毀等的相關規定。適用于微生物限度檢查、無菌檢查、抗生素微生物(效價)測定、評價防腐劑和抗菌劑的抑菌效果和確認滅菌效果、檢驗方法的驗證、培養基的適用性檢查,樣品檢驗時的陽性對照等。

依據: 中國藥典2010年版二部及菌種使用說明書


1.標準菌的來源
標準菌株由中國藥品生物制品檢定所醫學菌種保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷凍干燥菌種(0代)或由上級藥檢部門已接種好的菌種斜面(3代)。黑曲霉的0代菌種為保存于含15%甘油的0.9%無菌氯化鈉溶液中的孢子懸液冷存管。中國藥品生物制品檢定所醫學微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌種的標簽CMCC(B)代表細菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每種菌具有固定的代號。

2.標準菌的驗收
從菌種保藏中心購買的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干菌,接收同時應檢查是否有隨菌種附有的相關資料。接收菌種時應檢查安瓿的數量和名稱,和每一支安瓿的完整性。在相應的菌種接收記錄上記上所有的關于菌種的信息,如名稱、數量和接收日期等。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標簽,內容包括:菌種名稱、菌種代號、代次、接收日期、接收人、貯存條件、有效期至。新購入的0代原始菌種儲存于-20℃,有效期為三年。從上級藥檢部門購買的已接種好的菌種斜面(3代)應檢查菌種管是否完好。儲存于2~ 8 ℃,有效期為3個月。

3. 標準菌的復蘇、復壯及標準儲備菌株的制備

3.1物品及試劑:接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球

3.2培養基
改良馬丁瓊脂培養基:用于黑曲霉復蘇、復壯.
液體硫乙醇酸鹽培養基:用于生孢梭菌復蘇、復壯.
營養肉湯培養基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復蘇、復壯。
改良馬丁培養基:用于白色念珠菌復蘇、復壯.

3.3操作步驟
a.打開潔凈工作臺。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風干。
c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線,用手輕輕將安瓿掰開(開啟安瓿時必須小心,因為安瓿遇熱時可能會破裂)。
d.以無菌方法用一無菌吸管從已準備好的上述液體培養基中移取0.5~0.8 ml到安瓿中。
e.輕輕地旋轉安瓿以使凍干菌種和液體培養基充分混合并完全溶解。
f.用無菌吸管將安瓿內菌液全部轉接到相應的液體培養基。
g.根據安瓿上所標明的不同菌種類型而將其培養于相應的溫度(細菌培養溫度30~35℃,培養18~24小時;真菌培養溫度23~28℃,培養3~5天。觀察是否渾濁,渾濁說明菌種復蘇生長;若不渾濁,細菌應延長培養時間至7天,真菌應延長培養時間至14天,若仍未渾濁,滅菌處理。
h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內液體1~2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上,用吸管涂布均勻,置23~28℃培養5~7天,斜面正面為黑褐色厚絨狀,色澤均一,不應有雜色,斜面側面無色,接近菌層培養基略帶黃色。確認后用含有0.05%(ml/ml)的吐溫-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。
i.取經復蘇后的上述細菌菌液8-10ml至液體培養基中按g項操作對菌種進行復壯。以無菌技術向復壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻,1-2ml/管分裝于凍存管。每個菌種制備10支,按順序進行編號,最后一支做為質控管進行質量控制,即進行相應的確認。其余作為儲備管。黑曲霉的h項下洗脫液按h項下方法進行復壯,制成復壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術向復壯后的菌種中加入20ml 、30%的無菌甘油混勻,1-2ml/管封存于凍存管。制備10支,按順序進行編號,最后一支做為質控管進行質量控制,即進行相應的確認。其余作為儲備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標簽。內容包括:菌種名稱、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。
j.儲備菌種管制備成功,儲存于-20℃,有效期為三年。

3.4菌種確認
用無菌接種環從質控管中取細菌培養物接種到營養瓊脂培養基平板上,或相應的宜于該細菌生長的鑒別平板上,劃線分離出單個菌落。然后在30~35℃下培養2~3天;同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板,并在23~28℃下培養7天;培養后,觀察其菌落形態,應符合該菌種形態特征。

3.5污染處理
假如在該平板上發現有其他菌落生長,則說明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養物滅菌處理?蓪ふ以蛑匦路蛛x挑選純菌落轉接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲備菌種管

3.6菌種的傳代與保藏
將菌種接種至一新鮮培養基上,每萌發一次即稱為一代,因此,當原始菌種復溶并轉至新培養基內生長,即認為已傳代一次,從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代,冷凍干燥的原始菌種開啟后轉種后為第1代,直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數(自原始菌種凍干粉起)不得超過5代。

菌種的傳代保藏過程 
3.3項下標準菌的復蘇為傳第一代,復壯為第二代。 傳第三代時取1支凍存管自然解凍,將其轉接斜面菌種作為工作用菌種。此時,工作用菌種為第3代。工作用菌種,分為兩類:一類用于定期傳代(W3),一類用于實驗用(S3)。
定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下(斜面接種法):
(1)從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后,應在室溫放置約30分鐘。
(2)將裝有新鮮配制的培養基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期,和傳代菌種一并移入潔凈工作臺,打開紫外燈照射一小時。
(3)關閉紫外燈。點燃酒精燈,左手握住菌種斜面,將管口靠近火焰上方,右手拿接種棒后端,將接種環燒紅約30秒,隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼,往返通過三次。
(4)右手用無名指、小指及掌部夾住管塞,左手將管口在火焰上旋轉燒灼,右手再輕輕拔開管塞,將接種環伸入管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下,稍冷后再至菌苔上,刮取少量菌苔,隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方!
(5)塞上管塞,左手將菌種管放下,取營養瓊脂斜面(或改良馬丁瓊脂斜面)一支,照上述操作打開管塞,將接種環伸入管內至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線,然后從底部向上作連續曲線劃線,一直劃到斜面頂端,使細菌接種在斜面的表面上。
(6)取出接種環,在火焰上方將培養基管蓋上塞子,然后將接種過細菌的接種環在火焰上燒灼滅菌。
(7)將已接種好的細菌管置30~35℃細菌培養箱培養22 ~24h,真菌管置23~28℃真菌培養箱最多培養7天。

當工作用菌種傳代代數小于5時,可直接用上一代工作用菌種轉接下一代工作用菌種,如:(W3)可直接轉接為(W4)。按上述程序操作,直至(W4)轉為(W5)為止,需重新接種,舊的工作菌種進行銷毀。
 
菌種斜面的培養、保藏條件及時間
 
      菌種                                                          培養條件及時間                 培養基                  保存條件及時間
大腸埃希菌(CMCC(B)44102)                30~35℃22~ 24h         營養瓊脂培養基     2℃~ 8 ℃保存3個月
金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)        30~35℃22~ 24h         營養瓊脂培養基     2℃~ 8 ℃保存3個月
枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)            30~35℃22~ 24h         營養瓊脂培養基     2℃~ 8 ℃保存3個月
銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)            30~35℃22~ 24h         營養瓊脂培養基     2℃~ 8 ℃保存3個月
乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50094)    30~35℃22~ 24h         營養瓊脂培養基     2℃~ 8 ℃保存3個月
生孢梭菌(CMCC(B)64941)                    30~35℃22~ 24h         營養瓊脂培養基     2℃~ 8 ℃保存3個月
白色念珠菌(CMCC(F)98001)                 23~28℃ 最多7天       改良馬丁瓊脂培養基  2℃~ 8 ℃保存3個月
黑曲霉(CMCC(F)98003)                         23~28℃ 最多7天      改良馬丁瓊脂培養基  2℃~ 8 ℃保存3個月
短小芽孢桿菌(CMCC(B)63602)             30~35℃22~ 24h        營養瓊脂培養基     2℃~ 8 ℃保存3個月
注:菌種斜面1次/周觀察狀態是否正常。

3.7菌種的使用及銷毀
每次進行菌種復活時,只能復活一個菌種。如果要復活其他菌時,應對所用物品重新消毒滅菌。
每次操作,都應進行記錄。菌種管上應貼有牢固的標簽。標明菌種名稱、菌種代號、代次、傳代人、編號和傳代日期、貯存條件、有效期至等。
廢棄菌種及實驗用品廢棄物的處理:121℃ 高壓蒸汽滅菌30分鐘。并對操作過程進行記錄。

編輯:songjiajie2010

 
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