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一線總結!微生物取樣、樣品制備技巧及稀釋、接種、培養方法匯總!

放大字體  縮小字體 發布日期:2021-03-02  瀏覽次數:148
核心提示:一、樣品前處理(1)無論何種抽樣方案,均要求樣品有代表性。采樣過程遵循無菌操作程序,防止一切可能的外來污染。如果是冷凍樣品
 一、樣品前處理

(1)無論何種抽樣方案,均要求樣品有代表性。采樣過程遵循無菌操作程序,防止一切可能的外來污染。

如果是冷凍樣品按要求冷凍保藏,干燥食品可放在常溫冷暗處,易腐和冷藏樣品應放入10℃環境。冷凍樣品來不及檢驗應放入-15℃以下冰箱內,待檢樣品存放時間不應超過36h。

 

(2)樣品解凍

如果是冷凍樣品,樣品取出后,在0-8℃的冰箱中解凍,時間不超過18小時;也可在溫度不超過45℃環境中解凍,時間不超過15min。

 

(3)檢測前準備

實驗前將工器具移到無菌間,最好用紫外線照射20min分鐘滅菌消毒,達到無菌狀態。

操作試驗的準備物品均質杯、酒精及酒精棉、移液器、滅菌槍頭、平皿、稀釋液、剪刀、鑷子、無菌盆或筐等物品,檢查一下是否齊全。


二、檢測

1、 樣品標識

將樣品進行相應標識標記,其中菌落總數按照4789.2操作,每一個稀釋度做兩個平行,一般做三個稀釋度每個樣品一摞。

 

大腸菌群及金黃色葡萄球菌按照4789.3和4789.10中的MPN法檢測,每個稀釋度3根管,一般也是做3個稀釋度。

 

2 取樣

先將樣品外包裝正反面用酒精噴灑(如果樣品表面有冷凝水先擦拭干凈后再用酒精噴灑)

(1)固體樣品

① 75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍,再用火焰滅菌的剪刀剪開。

② 在電子稱上放上均質杯去皮調整至零。

③ 用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣,稱取25g有代表性樣品。

④ 加入225ml滅菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水(開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次,以殺滅從空氣中落入雜菌)后。

⑤ 擦拭干凈剪刀鑷子后浸泡于75%酒精容器中。

⑥將均質杯蓋上蓋子后8000轉均質1-2min后作為樣液。

(2)液體樣品

①冷凍樣品完全解凍后使用。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍,再用火焰滅菌的剪刀開啟,用滅菌吸管取充分混合后樣25ml。

加入225ml滅菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水混勻作為樣液。

 

(3) 粉末狀樣品以及半固體樣品

①將樣品混合均勻。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍,再用火焰滅菌的剪刀開啟,以無菌匙采取混合后樣10g。

③加入90ml滅菌磷酸鹽緩沖液,開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1-2次,以殺滅從空氣中落入雜菌。

④余同上。

 

三、稀釋方法

①從均質杯準確吸取樣液1mL混勻的樣液,然后沿管壁徐徐接種到含9ml磷酸鹽緩沖液里,蓋上試管塞后充分震蕩混勻為1:100稀釋液。(一定要槍頭尖端伸入稀釋液內2-3mL,以免吸入空氣進入移液器,污染樣品造成實驗失敗。)

③重復該操作,按需要配制1:1000、1:10000…稀釋液。

④為減少樣品稀釋誤差,在連續遞增稀釋時(原液在前稀釋液在后),每一稀釋液應充分振搖,使其均勻,同時每一稀釋度應更換一個槍頭。

⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。


四、樣液接種方法:

① 在無菌室,取出滅菌的槍頭或者滅菌的移液器,

② 準確吸取樣品勻液,1mL、1mL、1mL無菌操作分別以2~4s內完全注入已標識清楚的菌落總數平皿、大腸菌群以及金黃色葡萄球菌培養液中。

③  如果某一樣品液在接種前放置時間超過3 min,應重新均質。

④ 為了驗證稀釋液、培養基、平皿、槍頭等器具無菌需做空白對照。

 

五、傾注培養基

右手持培養基三角瓶(已放45℃的水浴中恒溫)置火焰旁邊,用左手拇指和食指或中指使平皿開啟不超過30°,迅速倒人培養基約15-20ml,加蓋后輕輕搖動培養皿,左三圈,右三圈,使培養基均勻分布在培養皿底部,然后平置于桌面。


六、培養

●  平皿倒置放入恒溫培養箱中(每垛最多堆放6個平皿,平皿間要留有空隙進行空氣流通,使培養物的溫度盡快與培養箱溫度達到一致),按所規定的時間溫度進行培養。

●  斜面、高層斜面、液體培養基立在試管架上放入恒溫培養箱中,按所規定的時間溫度進行培養,


七、計數判定及注意事項

由于細菌種類繁多,差別甚大。計數時一般用菌落計數器仔細觀察。必要時用放大鏡檢查,以防遺漏尤其是平皿邊緣生長的菌落。

計數方法參照GB 4789.2-2016方法。

稀釋度低的培養皿,微生物菌落和食品碎渣很難區分,一般吸取過濾網過濾后的稀釋液以減少食品碎渣的影響;

為了避免食品中的微小顆;蚺嗷械碾s質與細菌菌落發生混淆,不易分辨,可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板,不經培養,而于4℃環境中放置,以便計數時作對照觀察。

● 必要時,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在平板計數瓊脂中加入氯化三苯四氮唑TTC(100ml加入1ml 0.5%TTC),培養后菌落呈紅色,易于分別。

● 在發酵試驗中,發酵倒管的產氣量,多者可以使發酵倒管全部充滿氣體,少者可以產生比小米粒還小的氣泡,或發酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡,都應作進一步試驗。如果對產酸但未產氣的發酵有疑問時,可以用手輕輕打動試管,如有氣泡沿管壁上浮,就像啤酒中的二氧化碳氣泡一樣,即應考慮可能有氣體產生,而應作進一步試驗。

編輯:songjiajie2010

 
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